動物單細胞解離的實質(zhì)

　　破壞掉細胞間隙維系細胞關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)，使細胞分離開來。在動物細胞解離單細胞中通常采用膠原蛋白酶和胰蛋白酶來處理使組織細胞分離成單個細胞，從而制成單細胞懸液。

　　動物單細胞解離步驟

　　1.文獻資料查詢，樣本解離方案確定；

　　2.樣品接收（樣品接收時的溫度檢測記錄）；

　　3.組織解離器具準備；

　　4.組織剪切和清洗（去除等，剪切程度）；

　　5.酶液中組織的消化（組織轉(zhuǎn)移，雜交爐，計時，中間觀察）；

　　6.離心收集細胞（離心）；

　　7.去除死細胞提高細胞活率；

　　8.自動化細胞技術(shù)儀對細胞進行計數(shù)/臺盼藍熒光顯微鏡計數(shù)。

　　動物細胞的基本特性

　　1.相較于植物細胞動物細胞沒有細胞壁較為脆弱；

　　2.動物細胞的體積比微生物細胞大幾千倍，稍小于植物細胞的體積；

　　3.動物細胞的直徑一般在10μm-30μm；

　　4.大部分動物細胞在肌體內(nèi)相互粘連以集群形式存在。

　　動物單細胞懸液制備心得

　　人-胰腺

　　Ⅰ、解離

　　該樣品是儲存于組織保護液中48小時內(nèi)解離（對于-80℃儲存的組織解離時，37℃水浴復(fù)蘇，可邊搖晃邊水浴，盡可能縮短復(fù)蘇時間，保證組織的較好狀態(tài)）；

　　Ⅱ、組織剪切和清洗

　　由圖觀察，該組織塊較大，且組織表面附有血色斑塊物，在組織塊較大能夠保證獲取足量的細胞前提下可將該部分或明顯贓物去除，減輕后續(xù)除雜壓力，避免多次除雜步驟引起的細胞損失；組織塊盡量剪碎，可充分被酶液消化；

　　Ⅲ、酶解

　　根據(jù)以往解離經(jīng)驗，該組織可采取膠原酶II，37℃酶解（對于較難消化的組織可采取混合酶消化或提高酶量、消化時間）；

　　Ⅳ、計數(shù)

　　對于luna細胞計數(shù)儀，在計數(shù)剛消化下來的細胞且背景較高的細胞，計數(shù)虛高僅作為參考（且其中細胞平均粒徑這一參數(shù)很大程度上偏離解離樣本的細胞粒徑，計數(shù)越不可信）。

　　酶解1-2小時后取液染色鏡檢

　　經(jīng)過除雜處理后的最終細胞懸液鏡檢圖

　　解離小tips

　　1）現(xiàn)象：剪碎的組織在消化過程中出現(xiàn)溶液膠狀，組織塊分布在整個體系中，無法沉于底部

　　建議：可以加入適量的膠原酶II消化0.5-1小時

　　2）現(xiàn)象：鏡檢下的細胞仍存在細胞間交聯(lián)的情況

　　建議：可加入適量的DNA酶（可將包裹細胞的基因組進行酶解切斷，可改善部分細胞交聯(lián)現(xiàn)象）

　　3）現(xiàn)象：長時間消化仍未鏡檢出細胞

　　建議：1、保留剩余組織將上清離心然后以小體積重懸再鏡檢（過大的體積對于本就細胞數(shù)不多的情況下，很難鏡檢出細胞造成無細胞的假象）；2、使用膠管反復(fù)用力吹打組織（可能組織已被消化松散，單細胞仍交聯(lián)在一起）

　　4）現(xiàn)象：待解離組織塊小

　　建議：可采取1.5ml離心管進行消化（使酶充分接觸組織、減少試劑用量）

　　5）現(xiàn)象：在使用多種除雜方法后，細胞計數(shù)儀仍呈現(xiàn)出較多背景的情況

　　建議：可使用臺盼藍計數(shù)，以臺盼藍的計數(shù)結(jié)果為準

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